La microtomie consiste à préparer des coupes de tissus d’épaisseur variable (de quelques dizaines de nm à quelques centaines de µm) afin de pouvoir les examiner au microscope. Plusieurs techniques sont disponibles selon la nature des tissus, la méthode employée au préalable pour les fixer et les inclure et le type de microscope utilisé.

Microtome à paraffine

Ce microtome permet de réaliser des coupes de 4 à 10 µm à-partir de tissus prélablement fixés, déshydratés et inclus en paraffine. Les coupes sont ensuite fixées sur des lames de verre, déparaffinées et réhydratées. Selon les besoins, elles sont ensuite soumises à des colorations histologiques pour mettre en évidence l’organisation cellulaire des tissus ou immunomarquées par immunohistochimie ou immunofluorescence pour localiser des protéines d’intérêt ou des organites sub-cellulaires. En coupes paraffine, la structure tissulaire est très bien préservée ce qui en fait la technique de choix pour les études histologiques. En revanche, l’inclusion en paraffine peut altérer certains épitopes ce qui complique les immunomarquages. Il convient alors d’effectuer une restauration d’antigènes (généralement en traitant les coupes dans des tampons de composition et de pH variables à 100°C) avant de procéder aux immunomarquages.

Cryostat

Ce microtome permet de réaliser des coupes de 10 à 100 µm environ sur des tissus congelés. Les tissus peuvent être congelés à l’état frais (flash freezing) ce qui permet de préserver les épitopes les plus fragiles en vue d’un immunomarquage mais altère inévitablement la structure. La congélation peut également se faire sur des tissus fixés après cryprotection par immersion dans du sucrose ce qui préserve beaucoup mieux la structure (conseillé). Les coupes sont ensuite fixées à température ambiante sur des lames spéciales (Superfrost) puis colorées ou immunomarquées.

Vibratome

Cet appareil permet de réaliser des coupes de quelques dizaines à quelques centaines de µm sur des tissus fixés mais sans congélation, ni inclusion préalable. Cette technique conserve très bien la structure des tissus tout en préservant les épitopes en vue d’un immunomarquage. Du fait de l’épaisseur des coupes, les observations doivent se faire en microscoie confocale. C’est la technique de choix pour l’imagerie optique en haute résolution et en 3D. Elle est particulièrement bien adaptée aux organes pleins (foie, cerveau, …) mais peut également être utilisée sur des organes creux ou fragiles (placenta, intestin, …) après enrobage des tissus dans de l’agarose.

Ultramicrotome

Cet équipement permet de réaliser des coupes semi-fines (250 nm à 1µm) et ultra-fines (80 à 150 nm). Les tissus doivent être préalablement fixés, déshydratés et inclus dans une résine très dure (Epon). Cette technique est indispensable pour les observations de coupes en microscopie électronique à transmission.