Ces techniques permettent de localiser, voire de quantifier, dans des cellules ou des coupes de tissus, une molécule d’intérêt (le plus souvent une protéine) grâce à un anticorps spécifique dont la liaison sera révélée grâce à un anticorps secondaire couplé à une enzyme (immunohistochimie) ou un fluorophore (immunofluorescence). Les échantillons sont ensuite observés en microscopie optique à fond clair (immunohistochimie) ou en microscopie confocale (immunofluorescence).

Immunohistochimie

Les échantillons sont incubés avec l’anticorps primaire puis avec un anticorps secondaire couplé à la HRP (horseradish peroxidase). La révélation est faite en incubant les échantillons avec de la DAB (diaminobenzidine) qui, après oxydation par la HRP en présence de peroxyde d’hydrogène, forme un précipité brun facilement observable en microscopie optique à fond clair. Cette technique peut être couplée à une coloration histologique (type Hémalun-Eosine) pour faciliter la localisation du marquage dans les tissus.

Immunofluorescence

Les échantillons sont incubés avec l’anticorps primaire puis avec un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome. Comparée à l’immunohistochimie, l’immunofluorescence permet de réaliser facilement des multimarquages en combinant des anticorps secondaires émettant à différentes longueurs d’onde. Des sondes fluorescentes spécifiques permettent également de marquer différents organites intracellulaires (marquage des noyaux par le DAPI, des mitochondries par le Mitotracker ou des lysosomes par le Lysotracker par exemple) sans avoir recours à un anticorps. Par un choix judicieux de fluorochromes et d’anticorps on peut ainsi réaliser des marquages à 4 voire 5 couleurs. L’immunofluorescence est également à privilégier pour les analyses quantitatives (mesure de l’intensité de marquage).

Techniques amplifiées

Ces approches permettent d’amplifier le marquage et peuvent donc être mises en oeuvre pour visualiser des protéines faiblement exprimées par immunohistochimie ou immunofluorescence. On utilise pour cela des anticorps secondaires biotinylés dont le marquage est amplifié grâce à une streptavidine couplée à l’HRP ou à un fluorophore.

Immunomarquage ZO1 dans l’intestin de rat (Dr Bruno Saubaméa, PICMO)